BRAZOL - REAGENTE A BASE DE FENOL PARA EXTRAÇÃO DE DNA

Referência: 13-BR188


Não disponível

Enviar
Avise-me quando estiver disponível

ESTABILIDADE: ESTÁVEL POR UM ANO, DESDE QUE ARMAZENADO ENTRE 4° E 8°C. PODE SER TRANSPORTADO EM TEMPERATURA AMBIENTE, E NO RECEBIMENTO, IMEDIATAMENTE ARMAZENADO EM GELADEIRA.
 
DESCRIÇÃO: O BRAZOL É UM REAGENTE UTILIZADO NO ISOLAMENTO DE RNA A PARTIR DE AMOSTRAS DE CÉLULAS E TECIDOS. O BRAZOL É A VERSÃO OTIMIZADA DO POPULAR MÉTODO PASSO-ÚNICO DE ISOLAMENTO TOTAL DE RNA, BASEADO NA METODOLOGIA DESENVOLVIDA POR CHOMCZYNSKI & SACHI (1, 2, 3).
ESTA METODOLOGIA DE EXTRAÇÃO TEM SE MOSTRADO ALTAMENTE EFICAZ NA PURIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS A PARTIR DE MATERIAIS BIOLÓGICOS, TAIS COMO: SORO, PLASMA, SANGUE TOTAL COLETADO OU NÃO COM EDTA, CÉLULAS OBTIDAS A PARTIR DE CULTIVOS E/OU TECIDOS CONGELADOS. O PROTOCOLO A SEGUIR FOI PADRONIZADO PARA APLICAÇÃO EM PROTOCOLOS DE AMPLIFICAÇÃO E OUTRAS TÉCNICAS COMUNS EM LABORATÓRIOS DE BIOLOGIA MOLECULAR. ESTA TÉCNICA É CONFIÁVEL E POSSUI BOM DESEMPENHO PARA DIFERENTES QUANTIDADES DE AMOSTRAS.
 
O BRAZOL COMBINA AS PROPRIEDADES DO FENOL E DO ISOTIOCIANATO DE GUANIDINA, QUE INIBEM IMEDIATA E EFETIVAMENTE A ATIVIDADE DA ENZIMA RNASE. AS CÉLULAS PRESENTES NA AMOSTRA BIOLÓGICA SÃO LISADAS ATRAVÉS DESTE REAGENTE E, APÓS HOMOGENEIZAÇÃO E ADIÇÃO DE CLOROFÓRMIO E POSTERIOR CENTRIFUGAÇÃO, O PRODUTO RESULTANTE É SEPARADO EM DUAS FASES VISÍVEIS: AQUOSA E ORGÂNICA, RESPECTIVAMENTE.

O RNA PERMANECE EXCLUSIVAMENTE NA FASE AQUOSA, O DNA PODE SER ENCONTRADO NA INTERFASE ENTRE A FASE ORGÂNICA E A FASE AQUOSA E AS PROTEÍNAS EXCLUSIVAMENTE NA FASE ORGÂNICA (AZUL). O RNA PODE SER PRECIPITADO ATRAVÉS DA ADIÇÃO DE ISOPROPANOL GELADO SEGUIDO DE LAVAGENS COM ETANOL 70% E DISSOLVIDO EM ÁGUA OU TAMPÃO TE. O DNA E AS PROTEÍNAS PODEM SER PRECIPITADOS ATRAVÉS DA ADIÇÃO DE ETANOL E ISOPROPANOL, SEGUIDO DE LAVAGEM COM ETANOL.
 
PRECAUÇÕES ESPECIAIS DE MANUSEIO: O BRAZOL CONTÉM FENOL (TÓXICO) E ISOTIOCIANATO DE GUANIDINA (CÁUSTICO) QUE PODEM PROVOCAR QUEIMADURAS E, SE INGERIDO, PODE SER FATAL. AO EMPREGÁ-LO EM ROTINAS LABORATORIAIS UTILIZE SEMPRE LUVAS, AVENTAL E PROTETOR PARA OS OLHOS. EVITE O CONTATO COM A PELE OU COM A ROUPA E NÃO INALE SEU VAPOR.
LEIA AS NOTAS DE ADVERTÊNCIA CONTIDAS NO FRASCO QUE ACONDICIONA O PRODUTO.
EM CASO DE CONTATO ACIDENTAL: ENXÁGÜE IMEDIATAMENTE A REGIÃO ATINGIDA COM ABUNDANTE ÁGUA, POR PELO MENOS 15 MINUTOS E PROCURE IMEDIATAMENTE ORIENTAÇÃO MÉDICA.
 
REAGENTES NECESSÁRIOS, NÃO FORNECIDOS:

CLOROFÓRMIO; PODE SER SUBSTITUÍDO POR 1-BROMO-3-CLOROPROPANO (5)

ISOPROPANOL

ETANOL

ISOLAMENTO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS:
ESTA METODOLOGIA É EFICAZ PARA O ISOLAMENTO DE RNA DE DIFERENTES ESPÉCIES E AMOSTRAS, RARAMENTE OBSERVADA ATRAVÉS DE OUTROS MÉTODOS (4). UTILIZANDO-SE O BRAZOL PARA EXTRAÇÃO DE RNA, O TEMPO DE ENSAIO É EM TORNO DE UMA HORA. O PROTOCOLO PREVÊ BASICAMENTE A EXTRAÇÃO DE RNA TOTAL A PARTIR DE 100 µL DE VOLUME DE AMOSTRA PODENDO SER REALIZADO EM TUBOS DE 500 µL. PARA VOLUMES MAIORES, OU OUTRO TIPO DE AMOSTRAS, DEVE-SE MANTER A PROPORÇÃO ENTRE OS DIFERENTES REAGENTES BEM COMO A UTILIZAÇÃO DE TUBOS COM CAPACIDADE MAIOR. ACONSELHA-SE REALIZAR TODO O PROCEDIMENTO EM AMBIENTE CONTROLADO (15°C A 30°C), OBSERVANDO SEMPRE A UTILIZAÇÃO DE PONTEIRAS E TUBOS RNASE FREE, BEM COMO OS REAGENTES ADICIONAIS, ACIMA INDICADOS EM BAIXA TEMPERATURA.

PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO:
1 ? HOMOGENEIZAÇÃO:

  1. TECIDOS: 1 ML DE BRAZOL PARA CADA 50-100 MG DE TECIDO, MECANICAMENTE HOMOGENEIZADO. O VOLUME DA AMOSTRA NÃO DEVE EXCEDER 10% DO VOLUME DE BRAZOL USADO PARA HOMOGENEIZAÇÃO.
  2. CÉLULAS DE CRESCIMENTO EM MONOCAMADAS: LISAR AS CÉLULAS COLETADAS DIRETAMENTE DA PLACA DE CULTURA ADICIONANDO 1 ML DE BRAZOL PARA CADA 3,5 CM DE DIÂMETRO DA PLACA E PASSANDO O LISADO DE CÉLULAS VÁRIAS VEZES PELA PIPETA. A QUANTIDADE DE BRAZOL ADICIONADA É BASEADA NA ÁREA DA PLACA DE CULTURA (APROXIMADAMENTE 1 ML PARA 10 CM2) E NÃO NO NÚMERO DE CÉLULAS PRESENTES. UMA QUANTIDADE INSUFICIENTE DE BRAZOL PODERÁ RESULTAR NA CONTAMINAÇÃO DO RNA ISOLADO, COM DNA.
  3. CÉLULAS DE CRESCIMENTO EM SUSPENSÃO: CENTRIFUGAR AS CÉLULAS ATÉ FORMAR UM PELLET. LISAR AS CÉLULAS COM BRAZOL ATRAVÉS DE REPETIDAS PIPETAGENS. UTILIZAR 1 ML DO REAGENTE PARA CADA 5 ? 10 X 10DE CÉLULAS ANIMAIS, DE PLANTAS OU DE LEVEDURAS, OU PARA 1 X 10CÉLULAS BACTERIANAS. A LAVAGEM EXCESSIVA DAS CÉLULAS ANTES DA ADIÇÃO DE BRAZOL DEVE SER EVITADA PORQUE AUMENTA A POSSIBILIDADE DE DEGRADAÇÃO DO MRNA.
  4. SANGUE TOTAL: ADICIONAR 1 ML DE BRAZOL PARA CADA 300 ML DE AMOSTRA

2 ? AGITAR OS TUBOS POR INVERSÃO OU COM AUXÍLIO DE AGITADOR, TIPO VÔRTEX, POR 2 MINUTOS E ADICIONAR 250 ML DE CLOROFÓRMIO GELADO. AGITAR NOVAMENTE;
3 ? CENTRIFUGAR AS AMOSTRAS A 12.000 X G (APROXIMADAMENTE 10.000 RPM) A 4°C, POR 20 MINUTOS;
4 ? TRANSFERIR O SOBRENADANTE PARA NOVOS TUBOS CONTENDO 500 ML DE ISOPROPANOL GELADO NO PROCESSO DE EXTRAÇÃO DE RNA OU 500 ML DE ETANOL ABSOLUTO GELADO PARA O DNA;
5 ? AGITAR OS TUBOS POR INVERSÃO DURANTE 2 MINUTOS;
6 ? CENTRIFUGAR A 12.000 X G A 4°C, DURANTE 15 MINUTOS;
7 ? DESPREZAR O SOBRENADANTE POR ASPIRAÇÃO OU CUIDADOSA DECANTAÇÃO, OBSERVANDO PARA NÃO ELIMINAR O PELLET ;
8 ? LAVAR O PELLET COM 500 ML DE ETANOL 70%, HOMOGENEIZAR POR INVERSÃO E CENTRIFUGAR A 12.000 X G A 4°C, DURANTE 10 MINUTOS;
9 ? DESPREZAR O SOBRENADANTE COMO NA ETAPA 7, CUIDANDO PARA NÃO ASPIRAR O PELLET;
10 ? DISSOLVER O PELLET EM ÁGUA ESTÉRIL OU EM TAMPÃO TE 1X ESTÉRIL;
11 ? QUANTIFICAR A CONCENTRAÇÃO FINAL DOS ÁCIDOS NUCLÉICOS OBTIDOS ATRAVÉS DE LEITURA EM ESPECTOFOTÔMETRO OU ESTIMANDO A CONCENTRAÇÃO EM GÉIS DE AGAROSE, PARA O RNA TRABALHAR EM CONDIÇÕES DESNATURANTES;
 AS AMOSTRAS ASSIM PROCESSADAS ESTÃO PRONTAS PARA SEREM UTILIZADAS EM REAÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO E DEMAIS APLICAÇÕES DA BIOLOGIA MOLECULAR
 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

  1. CHOMCZYNSKI P AND SACCHI N (1987) SINGLE STEP METHOD OF RNA ISOLATION BY ACID GUANIDINUM THIOCYANATE-PHENOL-CHLOROFORM EXTRACTION. ANAL BIOCHEM, 162, 156-159.
  2. CHOMCZYNSKI P (1993) A REAGENT FOR THE SINGLE-STEP SIMULTANEOUS ISOLATION OF RNA, DNA AND PROTEINS FROM CELL AND TISSUE SAMPLES. BIOTECHNIQUES, 15, 532-537.
  3. MACKEY K AND CHOMCZYNSKI P (1996) LONG-TERM STABILITY OF RNA ISOLATION REAGENTS. J NIH RES., 8,72.
  4. AUSUBEL F M, BRENT R. KINGSTON R E, MOORE D D, SEIDMAN J G, SMITH J A AND STRUHL K (1999) APPENDIX 1, IN: CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL 2, P. A.1.5, JON WILEY AND SONS, INC., NEW YORK, NY.
  5. CHOMCZYNSKI P AND MACKEY K (1995) SUBSTITUITION OF CHLOROFORM WITH BROMOCHLOROPROPANE IN THE SINGLE-STEP METHOD OF RNA ISOLATION. ANAL BIOCHEM, 222, 163-164

OBS: ESTE PRODUTO É UTILIZADO ESTRITAMENTE EM PESQUISA CIENTÍFICA, NÃO RECOMENDADO PARA O USO EM DIAGNÓSTICO CLÍNICO OU TERAPÊUTICO

Deixe seu comentário e sua avaliação







- Máximo de 512 caracteres.

Clique para Avaliar


  • Avaliação:
Enviar
Faça seu login e comente.

Características