EASY TAQ DNA POLYMERASE

DESCRIÇÃO:
A ENZIMA TERMOESTÁVEL TAQ DNA POLIMERASE DE THERMUS AQUATICUS É A FORMA RECOMBINANTE DA ENZIMA EXPRESSA EM ESCHERICHIA COLI. APRESENTA ELEVADA PROCESSIVIDADE 5?À 3?, E UMA ATIVIDADE DE EXONUCLEASE 5´- 3´, PORÉM SEM ATIVIDADE EXONUCLEASE 3?À 5?.

A TAQ DNA POLIMERASE MOSTRA EXCELENTE ATIVIDADE EM PH 8,5 Á 72°C, SENDO ESTÁVEL NA INCUBAÇÃO EM ELEVADAS TEMPERATURAS (95°C).

A ENZIMA É CONSTITUÍDA POR UMA CADEIA POLIPEPTÍDICA SIMPLES COM PESO MOLECULAR DE APROXIMADAMENTE 94 KDA.

UNIDADE ENZIMÁTICA:
UMA UNIDADE DA TAQ DNA POLIMERASE É DEFINIDA COMO A QUANTIDADE NECESSÁRIA PARA INCORPORAR 10 NMOLES DE DNTPS EM 30 MINUTOS A 72°C, EM CONDIÇÕES DE ENSAIO PADRÃO.

COMPONENTES:
- ENZIMA TAQ DNA POLIMERASE,
- TAMPÃO DE AMPLIFICAÇÃO 10X (LIVRE DE ÍONS MG2+),
- 50 MM DE MGCL2

TAMPÃO DE ARMAZENAMENTO:
- 20 MM HEPES PH 7,9
- 100 MM KCL
- 0,1 MM EDTA
- 0,5 MM PMSF
- 1,0 MM DTT
- 50% GLICEROL

TAMPÃO DE REAÇÃO (10X):
- 100 MM TRISHCL PH 8,5
- 500 MM KCL

ENSAIOS DE CONTROLE DE QUALIDADE:

ATIVIDADE:
SDS-PAGE (PUREZA),
ESPECTROMETRIA DE MASSA (FIGURA 1),

OVER-DIGESTÃO: A INCUBAÇÃO DE 5U DA TAQ DNA POLIMERASE COM 1 MG DE DNA, EM TAMPÃO DE REAÇÃO PRÓPRIO DURANTE 16 HORAS À 72°C, FORNECE UM PADRÃO DE FRAGMENTOS DE CLIVAGEM NÍTIDO, LIVRE DE DNA DE E.COLI [3].

PROTOCOLO BÁSICO DE AMPLIFICAÇÃO:

A) UTILIZAR MICROTUBOS ESTÉREIS DE 0,2 ? 0,5 ML.
OS TUBOS DEVEM PERMANECER DENTRO DE GELO.

DETALHES SOBRE PARÂMETROS CRÍTICOS E INFORMAÇÕES ADICIONAIS PODEM SER ENCONTRADOS NA REFERÊNCIA [1].

PARA OBTER UM EXCELENTE RENDIMENTO NA AMPLIFICAÇÃO DE FRAGMENTOS DE DNA SÃO ACONSELHÁVEIS, A UTILIZAÇÃO DE UM KIT DE PIPETAS EXCLUSIVAS, PONTEIRAS COM BARREIRA E AMBIENTE LIVRE DE CONTAMINAÇÃO.

O PROTOCOLO SUGERIDO SERVE COMO UM GUIA GERAL E PONTO INICIAL DE PROTOCOLOS DE AMPLIFICAÇÃO DE DNA.

B) HOMOGENEIZAR A MISTURA, ATRAVÉS DE RÁPIDA CENTRIFUGAÇÃO (FAST-SPIN),

C) INCUBAR EM TERMO BLOCO À 94°C POR 3-5 MIN, PARA DESNATURAR O DNA,

D) PROCEDER COM 20 - 35 CICLOS DE AMPLIFICAÇÃO: DESNATURAÇÃO À 94°C POR 45 S; ANELAMENTO À 55°C [**] POR 30 S E EXTENSÃO À 72°C POR 1 MIN. ADICIONALMENTE UMA ETAPA DE EXTENSÃO À 72°C POR 10 MIN É RECOMENDADA.

MANTER À 4°C ATÉ A ANÁLISE.

E) ANALISAR OS PRODUTOS OBTIDOS ATRAVÉS DE ELETROFORESE EM GÉIS DE AGAROSE OU POLIACRILAMIDA, CORANDO COM BROMETO DE ETÍDEO E VISUALIZANDO EM LUZ ULTRAVIOLETA.

BIBLIOGRAFIA:

[1] INNIS, M. A. ET AL. (1990) PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, ACADEMIC PRESS, SAN DIEGO, CA.
[2] CHASSEING, H. AND LIPINSKI, R. (1998) CHARACTERIZATION OF HORSE KIDNEY METALLOTIONEIN ISOFORMS BY ELECTROSPRAY MS. AND REVERSED-PHASED HPLC-ELECTROSPRAY MS. ANALYST 123: 2125.
[3] BORNEMA, J. AND TRIPLET, F. W. (1997) MOLECULAR MICROBIAL DIVERSITY IN SOIL FROM EASTERN AMAZONIA: EVIDENCE FOR UNUSUAL MICRORGANISMS AND MICROBIAL POPULATION SHIFTS ASSOCIATED WITH DEFORESTATION. APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 63: 2647.

OBS: ESTE PRODUTO É UTILIZADO ESTRITAMENTE EM PESQUISA CIENTÍFICA, NÃO RECOMENDADO PARA O USO EM DIAGNÓSTICO CLÍNICO OU TERAPÊUTICO