MMLV RNASE H MINUS FIRST-STRAND CDNA SYNTHESIS KIT
Referência: 13-10504-005
ARMAZENAR A -20OC.
DESCRIÇÃO:
MMLV RNASE H MINUS FIRST-STRAND CDNA SYNTHESIS KIT É UM SISTEMA COMPLETO PARA SÍNTESE DA PRIMEIRA FITA DE MOLÉCULAS DE DNA COMPLEMENTAR (CDNA) A PARTIR DE RNA MENSAGEIRO (MRNA) OU RNA TOTAL. ESTE SISTEMA FOI OTIMIZADO PARA A AMPLIFICAÇÃO DE CDNA DE ATÉ APROXIMADAMENTE 13 KB.
A ENZIMA TRANSCRIPTASE REVERSA M-MLV RNASE MINUS É UMA VERSÃO MODIFICADA DA ENZIMA M-MLV APRESENTANDO MUTAÇÕES DE PONTO QUE REDUZEM A ATIVIDADE DE RNASE H E AUMENTAM A ESTABILIDADE TÉRMICA.
DEVIDO A REDUZIDA ATIVIDADE DE RNASE H, NÃO OCORRE A DEGRADAÇÃO DE MOLÉCULAS DE RNA DURANTE A ETAPA DE SÍNTESE DA PRIMEIRA FITA DE CDNA, RESULTANDO NA SÍNTESE DE UMA GRANDE QUANTIDADE DE MOLÉCULAS ?FULL-LENGTH? DE CDNA.
DEVIDO A AUMENTADA ESTABILIDADE TÉRMICA, A ENZIMA TRANSCRIPTASE REVERSA M-MLV RNASE MINUS PODE SER UTILIZADA NA SÍNTESE DE MOLÉCULAS DE CDNA EM ELEVADAS TEMPERATURAS (42 A 60OC), PROPORCIONANDO UM MAIOR RENDIMENTO DE MOLÉCULAS DE CDNA.
DEPENDENDO DA APLICAÇÃO DO CDNA, O USUÁRIO PODERÁ ESCOLHER ENTRE 2 TIPOS DE PRIMERS:
ANCHORED OLIGO(DT)20 PRIMER É UMA MISTURA DE 12 PRIMERS, CADA PRIMER CONSISTINDO DE UMA SEQUÊNCIA DE 20 BASES T SEGUIDOS POR 2 BASES ADICIONAIS REPRESENTADAS POR VN, AONDE V É DA, DC OU DG E N É DA, DC, DG OU DT. A "ANCORA" VN PERMITE A HIBRIDIZAÇÃO DOS PRIMERS SOMENTE NA EXTREMIDADE 3' DA CAUDA DE POLI-A DE MRNA, PROMOVENDO UMA SÍNTESE MAIS EFICIENTE DE MOLÉCULAS ?FULL-LENGTH? DE CDNA.
É O MÉTODO DE ESCOLHA PARA GERAÇÃO DE CDNA PARA EXPERIMENTOS DE ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA POR RT-QPCR DEVIDO A CONSISTÊNCIA DOS RESULTADOS.
RANDOM HEXAMER PRIMER É UMA MISTURA DE PRIMERS DE SEQUÊNCIA RANDÔMICA CONSISTINDO DE UMA SEQUÊNCIA DE 6 BASES N, AONDE N É DA, DC, DG OU DT. DEVIDO A HIBRIDIZAÇÃO DESTE PRIMER EM VÁRIAS SEQUÊNCIAS AO LONGO DA MOLÉCULA DE RNA, TEREMOS UMA REPRESENTAÇÃO UNIFORME DE TODAS AS MOLÉCULAS DE RNA.
SÃO UTILIZADOS NA GERAÇÃO DE CDNA A PARTIR DE RNAS QUE NÃO POSSUEM CAUDA POLI-A.
DESTA FORMA, A SÍNTESE DO CDNA PODE SER REALIZADA A PARTIR DE MRNA POLI-A+ OU RNA TOTAL.
NA PRÓXIMA ETAPA, A REAÇÃO DE PCR É REALIZADA UTILIZANDO PRIMERS ESPECÍFICOS PARA OS GENES DE INTERESSE.
NESTE CASO, RECOMENDAMOS O USO DOS SEGUINTES PRODUTOS: TAQ DNA POLIMERASE, HOT START TAQ DNA POLIMERASE, SYBR GREEN QPCR MASTER MIX, EVAGREEN QPCR MASTER MIX OU PROBE QPCR MASTER MIX
COMPONENTES DO KIT PARA 50 REAÇÕES
CÓD.. NO. | 13-10504-005 | 50 REAÇÕES |
50 µL | TRANSCRIPTASE REVERSA M-MLV RNASE MINUS 200 UNIDADES / µL | TAMPA VERMELHA |
200 µL | 5X TAMPÃO DE REAÇÃO FIRST-STRAND CDNA | TAMPA TRANSPARENTE |
100 µL | 10MM DNTP MIX | TAMPA BRANCA |
50 µL | ANCHORED OLIGO(DT)20PRIMER 50 µM | TAMPA AMARELA |
50 µL | RANDOM HEXAMER PRIMER 100 µM | TAMPA VERDE |
1000 µL | ÁGUA RNASE-FREE | TAMPA TRANSPARENTE |
NOTA IMPORTANTE:EVITE A CONTAMINAÇÃO POR RIBONUCLEASES
A PUREZA E INTEGRIDADE DO RNA É ESSENCIAL PARA A SÍNTESE DE MOLÉCULAS ?FULL-LENGTH? DE CDNA. COMO FORMA DE PREVENÇÃO PARA EVITAR A CONTAMINAÇÃO POR RIBONUCLEASES, RECOMENDAMOS O USO DE MATERIAIS PLÁSTICOS COMO MICROTUBOS E PONTEIRAS COM CERTIFICAÇÃO RNASE-FREE. USO DE ÁGUA PARA BIOLOGIA MOLECULAR COM ALTO GRAU DE PUREZA LIVRE DE RNASES. USO DE LUVAS DURANTE A MANIPULAÇÃO DAS AMOSTRAS POIS A PELE HUMANA É UMA FONTE DE RNASES. USO DO INIBIDOR DE RNASE INCLUSO NO KIT PARA PROTEGER O RNA DA ATIVIDADE DE RNASES.
INSTRUÇÕES PARA USO
1. DESCONGELAR, MISTURAR E CENTRIFUGAR RAPIDAMENTE TODOS OS COMPONENTES ANTES DO USO. MANTER OS REAGENTES NO GELO.
2. ADICIONAR OS SEGUINTES REAGENTES EM UM MICROTUBO RNASE-FREE MANTIDO NO GELO:
COMPONENTES | QUANTIDADE |
1 PG A 5 µG DE RNA TOTAL | X µL |
ANCHORED OLIGO(DT)20 PRIMER | 1 µL |
ÁGUA RNASE-FREE | COMPLETAR O VOLUME PARA 10 µL |
3. INCUBAR OS MICROTUBOS A 65OC DURANTE 5 MINUTOS.
4. MANTER OS MICROTUBOS NO GELO POR, PELO MENOS, 1 MINUTO.
5. PREPARAR A SEGUINTE MISTURA DE SÍNTESE DE CDNA, ADICIONANDO OS COMPONENTES NA SEGUINTE ORDEM:
COMPONENTES | 1 REAÇÃO | 10 REAÇÕES |
5X TAMPÃO DE REAÇÃO FIRST-STRAND CDNA | 4 µL | 40 µL |
10MM DNTP MIX | 2 µL | 20 µL |
TRANSCRIPTASE REVERSA M-MLV RNASE MINUS 200 UNIDADES / µL | 1 µL | 10 µL |
ÁGUA RNASE-FREE | 3 µL | 30 µL |
VOLUME | 10 µL | 100 µL |
6. ADICIONAR 10 µL DA MISTURA DE SÍNTESE DE CDNA EM CADA MICROTUBO CONTENDO O RNA ALVO E PRIMER.
VOLUME TOTAL DA REAÇÃO DE SÍNTESE DE CDNA: 20 µL
7. MISTURAR A SOLUÇÃO DOS MICROTUBOS ATRAVÉS DE PROCEDIMENTO DE PIPETAGEM.
8. INCUBAR OS MICROTUBOS DE ACORDO COM O PRIMER UTILIZADO PARA SÍNTESE DO CDNA:
ANCHORED OLIGO(DT)20 PRIMER 60 MINUTOS A 50OC*
PRIMER GENE-ESPECÍFICO 60 MINUTOS A 50OC
RANDOM HEXAMER PRIMER 10 MINUTOS A 25OC SEGUIDO POR 60 MINUTOS A 50OC
* PARA ALVOS DE MRNA COM ALTO CONTEÚDO DE BASES GC, RECOMENDAMOS A REALIZAÇÃO DA REAÇÃO DE TRANSCRIÇÃO REVERSA INCUBANDO OS MICROTUBOS DURANTE 60 MINUTOS A 55OC OU 60OC.
9. INCUBAR OS MICROTUBOS POR 5 MINUTOS A 85OC PARA INATIVAR A REAÇÃO.
10. MANTER OS MICROTUBOS NO GELO.
A MISTURA DE SÍNTESE DE CDNA PODE SER ARMAZENADA A -20OC OU UTILIZADA IMEDIATAMENTE EM REAÇÕES DE PCR E PCR EM TEMPO REAL.
PARA REAÇÕES DE PCR, UTILIZAR 1 A 5 µL DA MISTURA DE SÍNTESE DE CDNA COMO ALVO.
CONTROLE DE QUALIDADE
CADA LOTE DESTE PRODUTO É AVALIADO EM REAÇÕES DE PCR E QPCR EM TEMPO REAL EM UM TERMOCICLADOR ABI 7500 REAL-TIME PCR SYSTEM SEGUINDO O PROTOCOLO DESCRITO A SEGUIR UTILIZANDO 5 µL DO CDNA SINTETIZADO PELO MMLV RNASE H MINUS FIRST-STRAND CDNA SYNTHESIS KIT A PARTIR DE 1 µG DE RNA TOTAL PURIFICADO POR RNAZOL RT:
REAÇÃO DE PCR
PROTOCOLO REALIZADO SEGUINDO O MANUAL DO PRODUTO TAQ DNA POLIMERASE UTILIZANDO OS SEGUINTES COMPONENTES DA REAÇÃO DE PCR:
COMPONENTE DA REAÇÃO DE PCR | VOLUME | CONCENTRAÇÃO FINAL |
ÁGUA PARA BIOLOGIA MOLECULAR | 33,75 µL | |
10X TAMPÃO DE REAÇÃO 15 MM DE MGCL2 | 5 µL | 1X |
10 MM DNTP MIX | 1 µL | 0,2 MM |
10 µM PRIMER FORWARD | 2,5 µL | 0,5 µM |
10 µM PRIMER REVERSE | 2,5 µL | 0,5 µM |
TAQ DNA POLIMERASE 5U/µL | 0,25 µL | 1,25 U |
CDNA | 5UL | |
VOLUME TOTAL | 50 UL |
A REAÇÃO DE PCR FOI REALIZADA CONFORME AS SEGUINTES CONDIÇÕES DE CICLAGEM TÉRMICA:
TEMP | TEMPO | CICLOS | |
DENATURAÇÃO INICIAL | 95OC | 3 MINUTOS | |
DESNATURAÇÃO | 95OC | 30 SEGUNDOS | 35 CICLOS |
PAREAMENTO | 58OC | 30 SEGUNDOS | |
EXTENSÃO | 72OC | 45 SEGUNDOS | |
EXTENSÃO FINAL | 72OC | 10 MINUTOS |
A ANÁLISE DA REAÇÃO DE PCR EM UM GEL DE AGAROSE 2% DEVERÁ DEMONSTRAR A PRESENÇA DE UMA FORTE BANDA CORRESPONDENTE A UM PRODUTO DE PCR DE 496 PARES DE BASES DO GENE GAPDH HUMANO.
PCR QUANTITATIVO EM TEMPO REAL
PROTOCOLO REALIZADO SEGUINDO O MANUAL DO PRODUTO PROBE QPCR MASTER MIX UTILIZANDO OS SEGUINTES COMPONENTES DA REAÇÃO DE QPCR:
COMPONENTES | VOLUME | CONCENTRAÇÃO FINAL |
2X TAMPÃO DE REAÇÃO QPCR LOW ROX | 12,5 µL | 1X |
20 µM PRIMER DIRETO Produtos Visitados |