SYBR GREEN QPCR MASTER MIX LOW ROX (100 REAÇÕES)

Referência: 13-10505-01


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ARMAZENAMENTO: ?20°C.
ESTÁVEL POR 10 DIAS EM TEMPERATURA AMBIENTE

DESCRIÇÃO:
O KIT SYBR GREEN QPCR MASTER MIX LOW ROX É RECOMENDADO PARA ENSAIOS QUANTITATIVOS DE PCR (QPCR). ESTA MIX É COMPOSTA DO FLUORÓFORO SYBRGREEN E A ENZIMA RECOMBINANTE HOTSTART TAQ DNA POLYMERASE.
TAQ-HOT START - DNA POLIMERASE, TRATA-SE DA VERSÃO QUIMICAMENTE MODIFICADA DA ENZIMA TAQ DNA POLIMERASE HOT-START, QUE EVITA AMPLIFICAÇÕES INESPECÍFICAS DURANTE AS ETAPAS DA AMPLIFICAÇÃO. ESTA ENZIMA REQUER UMA ETAPA PRÉVIA DE ATIVAÇÃO DE 95ºC DURANTE 03 MINUTOS.
ESTA MIX É COMPATÍVEL COM A MAIORIA DOS EQUIPAMENTOS PARA QPCR, INCLUSIVE OS QUE NÃO REQUEREM O FLUORÓFORO DE REFERÊNCIA ROX. A SABER;
ROCHE LIGHTCYCLER 480, QIAGEN ROTOR-GENE Q / 3000 / 6000, EPPENDORF MASTERCYCLER EP REALPLEX / REALPLEX2 S, ILLUMINA ECO QPCR, BIO-RAD CFX96 / CFX384, BIORAD ICYCLER IQ / MYIQ / IQ5 AND THERMO SCIENTIFIC PIKOREAL REAL-TIME PCR, BIOER, APPLIED BIOSYSTEMS 7500 / 7500 FAST / VIIA 7 / QUANTSTUDIO 12K FLEX AND STRATAGENE MX3000P / MX3005P / MX4000.
COMPONENTES: 
CADA PRODUTO CONTEM REAGENTES SUFICIENTES PARA REAÇÕES DE VOLUME FINAL 25 ?L POR REAÇÃO.
 

CÓD. N°.

13-10505-01

100 REACTIONS

1,25 ML

2X SYBR GREEN QPCR MASTER MIX LOW ROX

D.A.

50 µL

HOT START TAQ DNA POLYMERASE

D.A.


PROTOCOLO:
ESTE PROTOCOLO INDICA AS CONCENTRAÇÕES SUGERIDAS PARA UM VOLUME FINAL DE 25 ?L. CONTUDO, ESTES VOLUMES PODEM SER MODIFICADOS, DE ACORDO COM OS ENSAIOS DE CADA PESQUISADOR.

1. DESCONGELAR OS COMPONENTES, EM TEMPERATURA AMBIENTE. QUANDO DESCONGELADOS, PREPARAR A MIX DE REAÇÃO CONTENDO; 2X SYBR GREEN MASTER MIX LOW ROX E OS PRIMERS PARA AMPLIFICAÇÃO DA REGIÃO ALVO. MISTURAR NO VÔRTEX E APÓS CENTRIFUGAR RAPIDAMENTE PARA COLETAR TODO O VOLUME DA REAÇÃO NO FUNDO DO TUBO. PARA MANTER OS COMPONENTES VIÁVEIS PERMANECER COM OS TUBOS NO GELO.
 
2. PREPARAR A MIX DE REAÇÃO COMO A SEGUIR:

COMPONENTE

VOLUME

CONC. FINAL

2X SYBRGREEN QPCR MASTER MIX OR
MASTER MIX LOW ROX

12.5 µL

1X

PRIMER FORWARD (10 µM)

0.5 µL

0.2 µM        (0.1 ? 0.5 µM)

PRIMER REVERSE (10 µM)

0.5 µL

0.2 µM        (0.1 ? 0.5 µM)

HOT START TAQ DNA POLYMERASE

0.5 µL

 

DNA TEMPLATE

< 11 µL

 

NUCLEASE-FREE WATER

 

 
Q.S.P. 25 µL


PARÂMETROS DE AMPLIFICAÇÃO RECOMENTDADOS:
2-PROTOCOLO STEP CYCLING

STAGE

STEP

TEMPERATURA

TEMPO

HOLD

DESNATURAÇÃO INICIAL

95OC

2 MIN

40 CYCLES

DESNATURAÇÃO

95OC

15 SEC

ANELAMENTO E EXTENSÃO

60OC
(DATA COLLECTION)

60 SEC*

CURVA DE MELTING (DISSOCIAÇÃO)

PROCEDER DE ACORDO COM CADA EQUIPAMENTO

 
* O TEMPO DE EXTENSÃO É DEPENDENTE DO TAMANHO DO AMPLICON. ALGUNS PRIMERS PODEM PRECISAR DE UMA ETAPA ADICIONAL DE CICLAGEM PARA UM MELHOR DESEMPENHO.

3- PROTOCOLO STEP CYCLING

STAGE

STEP

TEMPERATURA

TEMPO

HOLD

DESNATURAÇÃO INICIAL

95OC

2 MIN

40 CYCLES

DESNATURAÇÃO

95OC

15 SEC

ANELAMENTO

50OC  ? 60OC

15 SEC

EXTENSÃO

68OC ? 72OC
(DATA COLLECTION)

45 SEC

CURVA DE MELTING (DISSOCIAÇÃO)

PROCEDER DE ACORDO COM CADA EQUIPAMENTO


ENSAIOS DE CONTROLE DA QUALIDADE
ESTE KIT É TESTADO FUNCIONALMENTE EM ENSAIOS DE QPCR UTILIZANDO EQUIPAMENTOS APPLIED BIOSYSTEMS 7500 REAL-TIME PCR SYSTEM E LINE
GENE 9600 BIOER, SEGUINDO OS PROCEDIMENTOS DESCRITOS NESTA FICHA (PROTOCOLO DE CICLAGEM 2-PASSOS) PARA A DETECÇÃO DO GENE DE RNASE P A PARTIR DE 20 NG DE DNA GENÓMICO HUMANO COMO TEMPLATE.
O GENE DE RNASE P HUMANA É UM GENE DE CÓPIA ÚNICA QUE CODIFICA A FRACÇÃO DE RNA PARA A ENZIMA RNASE P.
A ANÁLISE DE ENSAIO DE QPCR EM TEMPO REAL DEVE DEMONSTRAR A DETECÇÃO DO GENE DE RNASE P HUMANO COM UM CT (LIMIAR DE CICLO) <30.

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